Bài báo đề xuất một công nghệ chip microfluidic mới để phát hiện ghép kênh của các vi sinh vật gây bệnh tôm. Nhóm nghiên cứu đã tích hợp công nghệ khuếch đại axit nucleic nhanh (MIRA) đa enzyme và phương pháp phát hiện huỳnh quang thời gian thực. Chip vi lỏng này cung cấp một giải pháp nhanh chóng, nhạy cảm và hiệu quả để phát hiện tại chỗ của các mầm bệnh tôm chính.
Nghiên cứu nền tảng và ý nghĩa
Ngành nông nghiệp tôm toàn cầu là một trong những thành phần kinh tế quan trọng nhất trong nuôi trồng thủy sản, nhưng ngành công nghiệp từ lâu đã phải đối mặt với các mối đe dọa từ một loạt các vi sinh vật gây bệnh. Những mầm bệnh này thường dẫn đến cái chết quy mô lớn của tôm, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất và lợi ích kinh tế. Bao gồm bệnh hoại tử gan cấp tính (AHPND), virus hội chứng điểm trắng (WSSV), virus hoại tử truyền máu và nhiễm máu tạo máu (IHHNV), tôm hemocyte iridovirus (shiv).
Các phương pháp phát hiện mầm bệnh truyền thống, như phản ứng chuỗi polymerase (công nghệ PCR), có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, nhưng rất phức tạp để vận hành, mất nhiều thời gian và dựa vào thiết bị phòng thí nghiệm. Những hạn chế này làm cho công nghệ PCR không phù hợp để kiểm tra tại chỗ nhanh chóng. Công nghệ MIRA đã trở thành một công cụ phát hiện phân tử phù hợp cho ứng dụng tại chỗ do các đặc tính khuếch đại nhanh chóng của nó dưới nhiệt độ không đổi và nhiệt độ bình thường.
Nguyên tắc công nghệ Mira
Công nghệ khuếch đại axit nucleic nhanh chóng ở nhiệt độ đa enzyme (Công nghệ MIRA) là một công nghệ khuếch đại nhiệt độ không đổi, dựa vào sức mạnh tổng hợp của nhiều protein chức năng ở nhiệt độ phòng để đạt được sự khuếch đại nhanh chóng của axit nucleic. Nó là một công nghệ phát hiện axit nucleic nhanh thực sự di động. So với PCR, Mira có nhiều lợi thế hơn.
Thiết kế và đổi mới chip Microfluidic
Sơ đồ sơ đồ của nền tảng phát hiện RPA trên chip cho một số vi sinh vật gây bệnh tôm quan trọng
(A) Cấu trúc của một con chip microfluidic loại đĩa. 1: buồng phản ứng; 2: Van bóng; 3: Cổng xả; 4: Cổng lấy mẫu;
(B) Chế độ xem bùng nổ. 5: Phim niêm phong nhiệt; 6: Chất nền Chip.
(C) Bố cục chi tiết của sáu bộ mồi trong khu vực. Mỗi bộ mồi được cố định trước trong buồng phản ứng được chỉ định.
(D) Hoàn thành quy trình vận hành trên nền tảng phát hiện RPA trên chip.
Bài báo đề xuất một chip microfluidic được tích hợp với công nghệ MIRA để phát hiện ghép kênh của các vi sinh vật gây bệnh tôm. Công nghệ microfluidic có thể kiểm soát chất lỏng trong các kênh cấp độ micron để thao tác chính xác, do đó đạt được phát hiện đa mục tiêu hiệu quả và chi phí thấp.
Chip có các tính năng thiết kế chính sau:
● Chip Microfluidic ly tâm
Chip áp dụng thiết kế ổ đĩa ly tâm, sử dụng lực ly tâm để phân phối đồng đều mẫu vào mỗi buồng phản ứng. Thiết kế này đơn giản hóa quá trình hoạt động và người vận hành có thể hoàn thành toàn bộ phản ứng bằng cách chỉ đơn giản là tiêm mẫu.
● Phát hiện đa mục tiêu
Chip được nhúng trước với các loại vi khuẩn cần được phát hiện: hoại tử gan cấp tính (V-AHPND), Virus hội chứng điểm trắng (WSSV), Virus hoại tử dưới da (IHHNV) ) Đầu dò mồi cho năm mầm bệnh. Thiết kế này có thể đồng thời phát hiện sáu mục tiêu gen trong một phản ứng, cho phép sàng lọc nhanh nhiều mầm bệnh.
● Phát hiện huỳnh quang thời gian thực
Phản ứng khuếch đại công nghệ MIRA trong chip được kết hợp với đầu dò huỳnh quang, có thể theo dõi tiến trình của phản ứng khuếch đại trong thời gian thực. Thiết kế đầu dò cho phép tín hiệu huỳnh quang chỉ được giải phóng khi sản phẩm khuếch đại được tạo ra, do đó đạt được phát hiện định lượng nhanh chóng và nhạy cảm.
● Hệ thống phản ứng nồng độ thấp
Mỗi đơn vị phản ứng của chip chỉ yêu cầu thể tích phản ứng 5 μL, giúp giảm đáng kể mức tiêu thụ thuốc thử. Khi toàn bộ hệ thống đang chạy, tối đa bốn mẫu có thể được xử lý đồng thời và mỗi mẫu có thể phát hiện năm mầm bệnh, cải thiện đáng kể hiệu quả phát hiện.
Độ nhạy, độ đặc hiệu và độ lặp lại
Hiệu suất của hệ thống chip bao gồm phát hiện đối xứng, cộng hưởng và độ lặp lại.
● Độ nhạy
Kết quả thử nghiệm cho thấy chip có thể phát hiện số lượng bản sao gen mục tiêu thấp tới 10 bản/μL, với độ nhạy tương đương hoặc thậm chí cao hơn các phương pháp PCR truyền thống. Độ nhạy cao này đảm bảo rằng công nghệ có thể phát hiện các cá nhân bị nhiễm sớm trong các ứng dụng thực tế, do đó cho phép sàng lọc sớm các mầm bệnh.
● Tính đặc hiệu
Thí nghiệm đã tiến hành các xét nghiệm phản ứng chéo trên một loạt các mầm bệnh không phải là mục tiêu và kết quả cho thấy chip rất đặc hiệu với các mầm bệnh đích và có thể phân biệt chính xác các loại mầm bệnh khác nhau. Các xét nghiệm về bệnh hoại tử gan cấp tính (V-AHPND), Virus hội chứng điểm trắng (WSSV), dưới da truyền nhiễm và hoại tử tạo máu khuếch đại không đặc hiệu.
● Độ lặp lại
Để đánh giá sự ổn định của phương pháp, nhóm nghiên cứu đã tiến hành nhiều thí nghiệm lặp đi lặp lại. Kết quả cho thấy hệ số biến đổi (giá trị CV) giữa các thí nghiệm khác nhau là nhỏ hơn 10%, cho thấy độ lặp lại và tính nhất quán thử nghiệm tốt.
Ứng dụng và lợi thế hiện trường
Thiết kế của chip vi lỏng công nghệ Mira mang lại cho nó những lợi thế ứng dụng thực địa đáng kể, đặc biệt phù hợp để phát hiện và giám sát mầm bệnh nhanh chóng trong canh tác tôm:
● Quá trình vận hành thuận tiện
Toàn bộ quá trình phát hiện chỉ yêu cầu tiêm mẫu vào chip và bắt đầu thiết bị phản ứng. Nó yêu cầu hầu như không có hoạt động thủ công và phù hợp cho những người không chuyên nghiệp sử dụng trên trang web.
● Khả năng phản hồi nhanh
Hệ thống có thể thu được kết quả kiểm tra trong vòng 20 phút, rút ngắn đáng kể thời gian thử nghiệm. Điều này rất quan trọng cho phản ứng bệnh nhanh trong các trang trại và giảm sự lây lan của mầm bệnh.
● Khả năng phát hiện đa kênh
Năm mầm bệnh chính có thể được xác định trong một xét nghiệm, giúp cải thiện đáng kể hiệu quả phát hiện và tiết kiệm chi phí và thời gian phát hiện.
Triển vọng công nghệ Mira
Mặc dù công nghệ PCR từ lâu đã được đánh giá là tiêu chuẩn vàng để phát hiện khuếch đại axit nucleic, công nghệ MIRA đã chứng minh tiềm năng ứng dụng lớn do phản ứng nhanh ở nhiệt độ không đổi, hoạt động đơn giản và yêu cầu thiết bị thấp. Bằng cách so sánh với PCR kết hợp với trình tự DNA, người ta thấy rằng kết quả phát hiện của chip khuếch đại đẳng nhiệt phù hợp với kết quả PCR về độ nhạy và độ đặc hiệu, và thời gian phản ứng của công nghệ MIRA được rút ngắn đáng kể. Do đó, các chip vi lỏng công nghệ Mira được coi là một công nghệ phù hợp hơn cho các ứng dụng hiện trường, đặc biệt là trong các môi trường đòi hỏi phải phát hiện mầm bệnh nhanh chóng và quy mô lớn.
Các chip microfluidic dựa trên công nghệ khuếch đại axit nucleic nhanh đa enzyme (MIRA) cung cấp một công cụ hiệu quả để phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong canh tác tôm. Công nghệ này có những ưu điểm của độ nhạy cao, độ đặc hiệu tốt, hoạt động dễ dàng và tốc độ phát hiện nhanh và có triển vọng ứng dụng rộng rãi trong phòng ngừa và kiểm soát bệnh nuôi trồng thủy sản. Với sự phát triển và tối ưu hóa công nghệ hơn nữa, hệ thống dự kiến sẽ được áp dụng để phát hiện các mầm bệnh dưới nước hơn, cho phép phòng ngừa và theo dõi bệnh tật rộng hơn.
Kết quả nghiên cứu cung cấp một phương pháp phát hiện sớm đáng tin cậy cho ngành nuôi trồng thủy sản, có thể làm giảm hiệu quả nguy cơ bùng phát bệnh, cải thiện hiệu quả sản xuất và sản lượng của các trang trại và đặt nền tảng kỹ thuật cho sự phát triển bền vững của ngành nuôi trồng thủy sản.