Thiết lập phương pháp phát hiện Micropterus Salmoides Rhabdovirus dựa trên CRISPR CAS13A System Express
Zhang Minlin, Huang Fengqi, Zuo Xiaoling, Liang Jiantao, Liang Kaishan, Dan Jinhong, Li Zongyang, Yu Jie, Luo Liyuan, Xie Zijie, Zhao Huihong Tạp chí Hydrobiology Trung Quốc, 2024, 48 (2): 283-291. Doi: 10.7541/2023.2023.0199
Micropterus salmoides, còn được gọi là cá bass California hoặc bass đen Mỹ, là một loại cá nước ngọt có nguồn gốc từ Bắc Mỹ. Trong những năm gần đây, nó đã trở thành một con cá nuôi quan trọng trên toàn thế giới vì nhu cầu thị trường cao của nó: Micropterus salmoides có thịt chắc chắn, ít xương, hương vị ngon, dinh dưỡng phong phú, đặc biệt là protein cao và chất béo thấp, đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng đối với thực phẩm lành mạnh. Do đó, giá thị trường tương đối cao và nó thường được sử dụng trong thị trường phục vụ cao cấp. Tăng trưởng nhanh: Micropterus salmoides phát triển nhanh chóng và thường có thể đạt được thông số kỹ thuật hàng hóa trong 6-8 tháng. Nó phù hợp cho việc nhân giống chu kỳ ngắn và có thể nhanh chóng nhận ra lợi nhuận đầu tư. Kháng bệnh mạnh: So với các loài cá nuôi khác, Micropterus salmoides có khả năng thích nghi mạnh mẽ với môi trường, dịch bệnh quy mô lớn hơn và giảm nguy cơ sinh sản. Nhân giống sinh thái: Bass lớn có thể được trộn với các loại cá nước ngọt khác như cá chép bạc và cá chép cỏ, giúp đạt được sự cân bằng sinh thái ao và tối đa hóa việc sử dụng tài nguyên, cải thiện hơn nữa hiệu quả nhân giống và các yếu tố khác. Nó được hoan nghênh bởi thực khách và nông dân nuôi trồng thủy sản, và quy mô sinh sản của nó đã phát triển nhanh chóng trong những năm gần đây.
Mặc dù micropterus salmoides tương đối kháng bệnh, nhưng chúng vẫn có thể mắc một số bệnh trong điều kiện nhân giống kém. Trong số đó, Micropterus salmoides rhabdovirus (MSRV) cực kỳ có hại: lần đầu tiên nó được phát hiện ở Florida, Hoa Kỳ vào năm 1991.
Các triệu chứng lâm sàng của cá bị bệnh
Trả lời: Âm trầm lớn khỏe mạnh, mũi tên chỉ ra túi lòng đỏ; B: Bass lớn bị bệnh, mũi tên chỉ ra túi lòng đỏ.
Nguồn truyền dẫn thường bị nhiễm cá hoặc cá trưởng thành, các vùng nước bị ô nhiễm và cá hoang mang virus; Virus này có thể được truyền qua tiếp xúc trực tiếp, bài tiết phân và các vùng nước, và có nhiều khả năng xảy ra trong chất lượng nước kém hoặc điều kiện nhân giống mật độ cao. khuếch tán. Virus có thể gây ra sự thờ ơ, lang thang, sưng bụng và biến dạng cơ thể ở cá vị thành niên, cũng như gây ra loét hoại tử và chảy máu đa cơ quan. Sau khi bị nhiễm bệnh, tỷ lệ tử vong vượt quá 90%.
Các triệu chứng lâm sàng của micropterus salmoides nhân tạo
A: Âm trầm mạnh mẽ; B, C, D: Bass lớn bị nhiễm bệnh nhân tạo.
Mỗi năm, hơn 30% số lượng Micropterus salmoides bị mất do MSRV. Hiện tại, các phương pháp điều trị và phát hiện cho virus vẫn chưa trưởng thành, và không có thuốc cụ thể để điều trị nó. Do đó, rất cần thiết phải phát hiện virus kịp thời trước khi nhiễm trùng và thực hiện các biện pháp phòng ngừa hiệu quả, điều này có thể làm giảm tổn thất trong quá trình nhân giống đến một mức độ nhất định;
Ngoài ra, rất khó để thực hiện phát hiện tại chỗ mà không cần thiết bị phát hiện phức tạp với công nghệ phát hiện hiện có. Trước thách thức này, nhóm nghiên cứu của Đại học Nông nghiệp Nam Trung Quốc đã phát triển một phương pháp phát hiện mới kết hợp Mira với CRISPR-SYSTE. Phương pháp này có độ đặc hiệu mạnh, độ nhạy cao và hoạt động đơn giản, giúp cải thiện đáng kể hiệu quả phát hiện của MSRV và cũng giúp phát hiện MSRV càng sớm càng tốt và thực hiện các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát.
Sàng lọc kết hợp mồi Mira
Hai cặp mồi Mira khác nhau đã được sử dụng để khuếch đại đoạn gen chứa trình tự mục tiêu và các sản phẩm khuếch đại đã được điện di gel agarose. Biểu đồ điện di được đặt tại vị trí 100 bp và các dải sáng xuất hiện trong cả ba làn, cho thấy có các sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu. Các dải mục tiêu được khuếch đại ở 250 bp trong làn 2 và 3 được phân tích định lượng bằng phần mềm Image J và kết quả phân tích định lượng được thể hiện bằng "giá trị màu xám". Từ kết quả phân tích, có thể kết luận rằng giá trị xám càng thấp, tốc độ sử dụng mồi càng cao, nghĩa là hiệu quả khuếch đại liên kết đặc biệt của mồi càng cao.
Kết quả cho thấy hiệu suất khuếch đại liên kết cụ thể cao khi cặp mồi Mira-F2/R2 được sử dụng.
Mira Primer Paier Sàng lọc Điện di Hình ảnh gel và Phân tích giá trị màu xám
Một. Làn điện di M: 2000 BP DNA đánh dấu; Làn điện di 1. Khuếch đại mẫu DNA âm; Làn điện di 2. Cặp mồi Mira-F1/R1 khuếch đại đoạn mục tiêu (224 bp như trong hộp); Làn điện di 3. Cặp mồi Mira-F2/R2 khuếch đại đoạn mục tiêu (255 bp như trong hộp); b. Phân tích giá trị màu xám băng tần (như trong hộp)
Hệ thống phát hiện CRISPR/CAS13A
Sau khi phản ứng của hệ thống phát hiện CRISPR/CAS13A được hoàn thành, nó được chiếu xạ với ánh sáng cực tím để quan sát kết quả.
Sơ đồ độ sáng hệ thống phát hiện CRISPR/CAS13A
1-3. Toàn bộ hệ thống với tiêu chuẩn RNA được thêm vào; 4. Không thêm crrNA; 5. Không có protein Cas13a được thêm vào; 6. Không có đầu dò phóng viên SSRNA nào được thêm vào; 7. Kiểm soát tiêu cực
CRISPR/CAS13A-MSRV Hệ thống phản ứng tối ưu
Chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm sử dụng các tiêu chuẩn RNA và RNA mẫu khuếch đại. Tốc độ định vị của RNA mục tiêu tốt hơn với crRNA2 so với crRNA1. CRRNA1 có tín hiệu huỳnh quang cuối cùng mạnh hơn CRRNA2. Việc sử dụng hỗn hợp crrNA 1+ crRNA2 theo tỷ lệ bằng nhau có thể kết hợp các lợi thế của cả hai và đạt được hiệu quả phản ứng tốt hơn.
Tối ưu hóa các điều kiện phản ứng phát hiện CRISPR/CAS13A-MSRV và kết quả phát hiện
Một. So sánh kết quả phát hiện của RNA tiêu chuẩn sử dụng crRNA với các chuỗi spacer khác nhau;
b. So sánh dữ liệu tín hiệu huỳnh quang của RNA tiêu chuẩn được phát hiện bởi hệ thống phát hiện ở các nhiệt độ khác nhau;
c. So sánh dữ liệu tín hiệu huỳnh quang của RNA tiêu chuẩn được phát hiện bằng cách sử dụng các đầu dò của RNA Reporter với các nồng độ khác nhau;
d. So sánh kết quả phát hiện của RNA tiêu chuẩn được phát hiện bằng cách sử dụng các phức hợp thăm dò CAS13A/CRRNA với các tỷ lệ nồng độ khác nhau;
Để khám phá ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hệ thống phát hiện, nhiệt độ phản ứng khác nhau là 31 độ, 34 độ, 37 độ và 41 độ đã được đặt. Nhiệt độ phản ứng tối ưu của hệ thống phát hiện CRISPR/CAS13A-MSRV là 37 độ.
Để khám phá ảnh hưởng của nồng độ đầu dò của phóng viên SSRNA đối với hệ thống phát hiện, trong phạm vi thử nghiệm, cường độ huỳnh quang có mối tương quan tích cực với nồng độ đầu dò của phóng viên SSRNA. Hiệu ứng phát hiện của nồng độ đầu dò của phóng viên SSRNA không khác nhiều ở 500-700 nmol/l. Xem xét các vấn đề kinh tế thực tế, nồng độ thăm dò SSRNA tối ưu là 500nmol/L.
Để khám phá ảnh hưởng của các tỷ lệ nồng độ phản ứng CAS13A và CRRNA khác nhau đối với hệ thống phát hiện, khi tỷ lệ CAS13A: CRRNA là 4: 1 và 3: 1 dựa trên tỷ lệ 100nmol/L mỗi phần, CAS13A đạt độ bão hòa; Khi lượng Cas13a không đổi, cường độ của tín hiệu huỳnh quang không tương quan dương với sự gia tăng lượng crRNA. Do đó, khi tỷ lệ CAS13A so với CRRNA là 2: 1, hệ thống phát hiện CRISPR/CAS13A-MSRV có thể đạt được hoạt động phát hiện tối đa.
Đánh giá độ nhạy
Để khám phá nồng độ phát hiện tối thiểu của MSRV bằng hệ thống phát hiện CRISPR/CAS13A-MSRV, tiêu chuẩn RNA đã được pha loãng 10 lần trong một loạt và được phát hiện bởi hệ thống phát hiện CRISPR/CAS13A-MSRV. Hệ thống phát hiện CRISPR/CAS13A-MSRV có thể phát hiện ít nhất 100fm RNA mục tiêu MSRV. Khi nồng độ RNA mục tiêu thấp hơn 100fm, tín hiệu huỳnh quang được phát hiện bởi máy không khác biệt đáng kể so với điều khiển trống. Do đó, hệ thống phát hiện CRISPR/CAS13A-MSRV có thể phát hiện ít nhất 100fm ssRNA MSRV.
Đánh giá tính đặc hiệu của hệ thống phát hiện CRISPR/CAS13A-MSRV cho MSRV
Kiểm tra mẫu
Đối với các mẫu cá bị bệnh có dấu hiệu bệnh rõ ràng được thu thập từ các trang trại cá vược, chúng tôi đã xác minh xem mầm bệnh bị nhiễm cá là MSRV. Chúng tôi đã sử dụng các đoạn mồi dành riêng cho chuỗi protein capsid MSRV để khuếch đại PCR và gửi các dải tương ứng trong sơ đồ điện di để thử nghiệm. Sau khi so sánh, chúng tôi đã xác nhận rằng đó là MSRV.
Xác nhận thông tin trình tự MSRV
Một. Khuếch đại PCR của dải sản phẩm 228 bp của mồi MSRV; b. Trình tự protein capsid của MSRV so với NCBI, các trình tự đậm là các vị trí liên kết mồi ngược dòng và xuôi dòng và các khu vực bóng mờ là các vị trí mục tiêu cho liên kết CRISPR/CAS13A-MSRV CrRNA1
Các mẫu cá bị bệnh bị nhiễm MSRV đã được xử lý trước và được trình bày trước RNA virus, và sau đó được thử nghiệm với nhóm kiểm soát âm tính. Đồng thời, cDNA của các mẫu được trích xuất để so sánh với qPCR thông thường. Các mẫu dương (số 3, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14 và 15) được phát hiện bởi hệ thống phát hiện CRISPR/CAS13A-MSRV giống như kết quả của qPCR thông thường, trong đó giá trị CQ của qPCR nằm trong khoảng từ 18 đến 25; Trong khi số chu kỳ ngưỡng của các mẫu âm (số 1, 2, 4, 5, 9, 10 và 11) lớn hơn 38, cho thấy các mẫu không mang virus MSVR. Tóm lại, dữ liệu phát hiện của hệ thống phát hiện CRISPR/CAS13A-MSRV và RT-QPCR thông thường là nhất quán, chỉ ra rằng hệ thống phát hiện CRISPR/CAS13A-MSRV là khả thi và có thể thay thế các phương pháp phát hiện thông thường và phức tạp ban đầu ở một mức độ nhất định.
Biểu đồ so sánh dọc của dữ liệu phát hiện qPCR mẫu với qPCR và CRISPR
Một. Phát hiện qPCR của sơ đồ số chu kỳ ngưỡng mẫu lâm sàng MSRV; Số chu kỳ mẫu được phát hiện được so sánh với số chu kỳ tham chiếu âm bằng phân tích tests t (** p<0.01);
b. CAS13A kết hợp với Mira phát hiện Sơ đồ huỳnh quang mẫu lâm sàng MSRV; Giá trị huỳnh quang mẫu được phát hiện được so sánh với giá trị huỳnh quang tham chiếu âm bằng cách sử dụng phân tích bài kiểm tra t (** p<0.01)
Tóm lại, phương pháp phát hiện CRISPR/CAS13A-MSRV được thiết lập trong nghiên cứu này không yêu cầu các dụng cụ thử nghiệm đắt tiền, làm cho phát hiện tại chỗ nhanh chóng, chính xác và thuận tiện. Do đó, nếu phương pháp phát hiện này được sử dụng để khám phá kịp thời MSRV trong quá trình nhân giống thực tế và thực hiện các biện pháp nhắm mục tiêu và hiệu quả, nó có thể làm giảm đáng kể các tổn thất do các bệnh trong quá trình nhân giống. Ngoài ra, phương pháp phát hiện này nhanh, rất nhạy cảm và cụ thể, và có triển vọng ứng dụng và quảng bá tuyệt vời.