Phát triển một cuốn tiểu thuyết CAS13A/CAS12A qua trung gian"One-pot" kép Xét nghiệm phát hiện cho cây trồng biến đổi gen
Cây trồng biến đổi gen đã được trồng rộng rãi trên khắp thế giới và nhiều quốc gia đã dần dần cải thiện các biện pháp điều tiết của họ để đảm bảo an toàn cho các loại cây trồng biến đổi gen. Sự phát triển của các phương pháp phát hiện di truyền tại chỗ nhanh chóng và chính xác là rất quan trọng đối với nông nghiệp và an toàn sinh học, và có thể làm giảm bớt các mối quan tâm của công chúng về các sản phẩm biến đổi gen.
Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu đã phát triển một phản ứng một nồi mới -- Phát hiện kép MIRA kết hợp với CRISPR kép (phương pháp MR-DCA) để phát hiện đồng thời CaMV35 và các mục tiêu di truyền NOS trong các loại cây trồng được biến đổi gen, cung cấp một phương pháp phát hiện đơn giản và hiệu quả.
Phương pháp thử nghiệm
Sản phẩm kép MIRA được phân tích bằng hệ thống kép CAS13A và CAS12A để tạo ra hai tín hiệu độc lập không can thiệp lẫn nhau, và sau đó màu huỳnh quang được đọc bởi một dụng cụ chiếu sáng hoặc bằng một dải thử nghiệm với hai dòng T để đạt được khả năng đọc kênh kép. Toàn bộ quá trình được hoàn thành trong vòng chưa đầy 35 phút, với giới hạn phát hiện thấp tới 20 bản.
(Nguyên tắc phát hiện MR-DCA của Camv35s và NOS)
Toàn bộ thí nghiệm được chia thành ba bước: khuếch đại Mira, phản ứng CRISPR và hai phương pháp giải thích kết quả.
Gen Camv35S được sử dụng làm mục tiêu của CAS13A và gen NOS được sử dụng làm mục tiêu của CAS12A. Hai cặp mồi Mira được thiết kế tương ứng. Hệ thống CAS13A chỉ nhận ra RNA, do đó, vùng mồi phía trước được thiết kế, chứa một bộ khởi động T7 để phiên mã và kích hoạt CAS13A tiếp theo. Một PAM được thêm vào gen NOS. Các bổ sung ở trên đảm bảo rằng cả protein CAS13A và CAS12A đều có thể liên kết với các CRRNA tương ứng của chúng và không có nhiễu hoặc phản ứng chéo giữa hai hệ thống.
Tình hình thử nghiệm
Độ nhạy và độ đặc hiệu
Mẫu được pha loãng trong một gradient để kiểm tra cường độ huỳnh quang của phản ứng MIRA. Nó đã được tìm thấy rằng cường độ huỳnh quang vẫn có thể được phát hiện ở nồng độ mẫu 20 μL. Nồng độ 20 μL cuối cùng đã được chọn cho thí nghiệm.
(Nồng độ mẫu và dải thử khác nhau được sử dụng để phát triển màu sắc và tính toán định lượng cường độ)
Để đánh giá thêm tính đặc hiệu của MR-DCA, nhóm nghiên cứu đã thử nghiệm các mẫu hỗn hợp của động vật không chuyển gen và thực vật không chuyển gen. Kết quả cho thấy chỉ các mẫu biến đổi gen có chứa CaMV35 và NOS có tín hiệu huỳnh quang cao, trong khi cường độ huỳnh quang của các mẫu khác gần với kiểm soát âm. MR-DCA có thể được sử dụng như một nền tảng phát hiện axit nucleic mục tiêu kép cụ thể.
24 mẫu cây trồng đã được thử nghiệm bởi MR-DCA. Trong số đó, 1, 2, 15, 16, 21 và 22 là ngô chuyển gen có chứa chất kích thích CaMV35S. 7, 8, 23 và 24 là gạo chuyển gen kháng bệnh có chứa NOS Terminator. 3, 4, 11, 12, 13, 14, 17 và 18 là đậu nành biến đổi gen có chứa chất kích thích Camv35S và Terminator NOS.
(Kết quả kiểm tra của 24 mẫu)
Phản ứng nhanh
Thời gian phản ứng là một yếu tố quan trọng trong phát hiện tại chỗ. Nhóm nghiên cứu đã quan sát thấy rằng các tín hiệu huỳnh quang của FAM và HEX có thể được phát hiện bởi một công cụ huỳnh quang khi thời gian phản ứng là 10 phút. Mira kết hợp với phản ứng CRISPR cũng quan sát thấy huỳnh quang màu vàng sau 15 phút.
(Tín hiệu huỳnh quang ở các thời điểm phản ứng MIRA khác nhau)
(Sự phát triển màu của các dải thử nghiệm ở các thời điểm phản ứng MIRA khác nhau và tính toán định lượng cường độ)
Kết luận thử nghiệm
Các kết quả thử nghiệm cho thấy MIRA kép có độ đặc hiệu tốt và có thể thu được chính xác các sản phẩm khuếch đại của CaMV35S và NOS. Các hệ thống CAS13A và CAS12A phản ứng độc lập mà không can thiệp vào nhau. Thử nghiệm MR-DCA có thể phát hiện chính xác 20 bản sao ở nhiệt độ thấp là 35 phút, có giá trị lớn trong việc phát hiện các loại cây trồng biến đổi gen trong lĩnh vực này.
Thông tin bài viết
Tạp chí Tên: Tạp chí Nghiên cứu nâng cao Express
Tiêu đề bài viết: Phát triển một mới CAS13A/CAS12A qua trung gian xét nghiệm phát hiện kép cho cây trồng biến đổi gen Express
Yếu tố tác động: 11.4
Nhóm nghiên cứu: Wang Xiaofu, Học viện Khoa học Nông nghiệp Chiết Giang