Phát hiện nhanh chóng và có thể nhìn thấy chaphamaparvovirus ở mèo bằng cách sử dụng phương pháp khuếch đại nhanh đẳng nhiệt đa enzyme và xét nghiệm que thăm dòng chảy bên
tạp chí:Biên giới trong vi sinh học tế bào và nhiễm trùng
Yếu tố tác động:4.6
Chaphamaparvovirus ở mèo(FeChPV)là một loại parvovirus mới, được phát hiện lần đầu tiên ở mèo bị tiêu chảy ở Canada vào năm 2019. Khả năng gây bệnh và đặc điểm phân tử của nó vẫn chưa rõ ràng, đồng thời nó biểu hiện sự đa dạng về vật chủ và di truyền, cần phải điều tra dịch tễ học thêm. Hiện tại, không có phương pháp tiêu chuẩn hóa nào để phát hiện FeChPV.
Phương pháp que nhúng dòng chảy bên-khuếch đại đẳng nhiệt nhanh đa enzyme (MIRA-LFD)đã được sử dụng thành công để phát hiện các loại virus khác nhau, mang lại những ưu điểm như nhanh chóng, đơn giản và không cần dụng cụ chính xác. Nhóm nghiên cứu đã thiết lập phương pháp MIRA-LFD phù hợp với FeChPV để giải quyết những thách thức trong việc phát hiện lâm sàng ở cấp cơ sở. Không dựa vào các dụng cụ chính xác,phương pháp MIRA-LFD đã hoàn thành việc phát hiện FeChPV ở nhiệt độ 37 độ trong vòng 20 phút và không cho thấy phản ứng chéo-với các vi-rút khác. Giới hạn phát hiện là 32,3 bản sao/μL,cao gấp 10 lần so với phương pháp PCR. Hơn nữa, phương pháp MIRA-LFD đã phát hiện 29 mẫu dương tính với FeChPV-trong số 417 con mèo bị tiêu chảy, với tỷ lệ dương tính cao hơn một chút so với phương pháp PCR lồng nhau. Những kết quả này chỉ ra rằng phương pháp MIRA-LFD đã được thiết lập để phát hiện FeChPV là một phương pháp hiệu quả, kinh tế, đáng tin cậy và đơn giản, góp phần ngăn ngừa và kiểm soát sớm tình trạng nhiễm FeChPV.
1.Phương pháp thực nghiệm
Mẫu lâm sàng:Các mẫu tăm bông trực tràng được sử dụng trong nghiên cứu này được thu thập từ 632 con mèo (bao gồm 417 con bị tiêu chảy và 115 con mèo khỏe mạnh) và 474 con chó (bao gồm 342 con bị tiêu chảy và 132 con chó khỏe mạnh) tại các phòng khám thú y ở các tỉnh Quảng Đông, Hà Nam, An Huy, Chiết Giang và Khu tự trị Nội Mông từ năm 2022 đến năm 2024.
Khuếch đại axit nucleic:Axit nucleic DNA chiết xuất được thêm vào hệ thống MIRA. Recombinase và mồi tạo thành phức hợp; với sự trợ giúp của các protein phụ trợ và các protein liên kết-chuỗi đơn, chúng đã xâm chiếm mẫu DNA-chuỗi kép. Các đoạn mồi liên kết với các vùng bổ sung tương đồng để tạo thành vùng vòng lặp D-, trong khi recombinase được tách ra khỏi phức hợp. Polymerase liên kết với đầu 3' của mồi và bắt đầu quá trình tổng hợp DNA, khuếch đại vùng mục tiêu trên khuôn theo cấp số nhân. Quá trình này diễn ra nhanh chóng và hiệu quả, nhờ đó đạt được khả năng khuếch đại cực nhanh của mảnh mục tiêu chỉ trong 15 phút.
Phát triển màu của dải thử nghiệm:Sản phẩm khuếch đại axit nucleic được pha loãng theo tỷ lệ 1:10, bôi lên que thử và đọc kết quả sau 5 phút.
Toàn bộ quá trình từ khuếch đại axit nucleic đến phát triển màu của dải thử nghiệm chỉ mất 20 phút.
Amp-các sản phẩm sinh học trong tương lai đã được sử dụng trong thử nghiệm:
Trong nghiên cứu này, bốn bộ kết hợp thăm dò mồi{0}}cụ thể được thiết kế đã được sàng lọc. Cả điện di trên gel agarose và que thử axit nucleic đều được sử dụng để trình bày kết quả. Tất cả bốn kết hợp thăm dò mồi-có thể phát hiện vi-rút FeChPV. Theo kết quả điện di trên gel agarose, tổ hợp FeChPV-4 cho thấy dải mục tiêu sáng nhất nên tổ hợp này được chọn để thử nghiệm tiếp theo.
Theo kết quả điện di trên gel agarose, khuếch đại trong 5, 10, 15 và 20 phút đều mang lại dải mục tiêu. Cường độ dải mục tiêu đạt cực đại sau 15 phút khuếch đại, coi 15 phút là thời gian phản ứng tối ưu cho xét nghiệm này. Khuếch đại ở 36 độ, 37 độ, 38 độ, 39 độ và 40 độ đều tạo ra dải mục tiêu, với dải sáng nhất quan sát được ở 39 độ, thiết lập 39 độ là nhiệt độ phản ứng tối ưu cho xét nghiệm này.
(Hình A: 1: Khuếch đại 5 phút; 2: Khuếch đại 10 phút; 3: Khuếch đại 15 phút; 4: Khuếch đại 20 phút) (Hình B: 1: Khuếch đại 36 độ; 2: Khuếch đại 37 độ; 3: Khuếch đại 38 độ; 4: Khuếch đại 39 độ; 5: Khuếch đại 40 độ)
2. Hiệu suất phát hiện
Độ nhạy:
(Hình A: Kết quả MIRA được trình bày bằng phương pháp điện di trên gel agarose)
(Hình B: Kết quả PCR lồng nhau được trình bày bằng phương pháp điện di trên gel agarose)
(Hình C: Kết quả MIRA được trình bày bằng que thử axit nucleic)
Các mẫu được pha loãng nối tiếp 10 lần bắt đầu từ 3,23×10⁶ bản sao/μL. PCR lồng nhau bằng điện di trên gel agarose có thể phát hiện ổn định 3,23×10² bản sao/μL; MIRA với điện di trên gel agarose và MIRA với que thử axit nucleic đều có thể phát hiện ổn định 3,23×10¹ bản sao/μL.
Phương pháp MIRA cho thấy độ nhạy nhất quán khi sử dụng hai định dạng trình bày kết quả khác nhau và độ nhạy của phương pháp MIRA vượt trội so với phương pháp PCR lồng nhau.
Tính đặc hiệu:
(1: FeChPV, chaphamaparvovirus ở mèo; 2: FPV, virus giảm bạch cầu ở mèo; 3: FeAstV, astrovirus ở mèo; 4: FBoV, bocavirus ở mèo; 5: CachaV, chaparvovirus ở chó; 6: đối chứng âm tính)
Phương pháp MIRA-LFD mới được thiết lập chỉ phát hiện FeChPV và không cho thấy phản ứng chéo-với các vi-rút tham chiếu khác, cho thấy độ đặc hiệu tốt.
3.Tóm tắt nghiên cứu
Nghiên cứu này đã thiết lập phương pháp MIRA-LFD để phát hiện FeChPV mà không cần các công cụ-có độ chính xác cao. Là phương pháp phát hiện hiệu quả, tiết kiệm và đáng tin cậy với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phương pháp MIRA-LFD phù hợp hơn để phát hiện lâm sàng, cung cấp hỗ trợ kỹ thuật để phòng ngừa và kiểm soát sớm nhiễm FeChPV.
4.AMP-CÔNG NGHỆ SINH HỌC TƯƠNG LAI
Khuếch đại axit nucleic nhanh đẳng nhiệt đa enzyme MIRA là một công nghệ thực sự cho phép-phát hiện nhanh tại chỗ.
Công nghệ MIRA dựa trên cơ chế sửa chữa tái tổ hợp gen in vivo, dựa vào hoạt động hiệp đồng của nhiều protein chức năng ở nhiệt độ phòng để đạt được sự khuếch đại axit nucleic nhanh chóng (5-20 phút), nhạy, đặc hiệu và an toàn ở nhiệt độ phòng (25 độ –45 độ ). Do tính chất đẳng nhiệt của công nghệ MIRA nên nó có yêu cầu thiết bị thấp và vận hành đơn giản. Thông qua các thiết bị di động thu nhỏ, nó có thể được áp dụng trong thử nghiệm tuyến đầu trong nhiều tình huống ứng dụng khác nhau, mang lại khả năng xét nghiệm axit nucleic nhanh chóng và chính xác cho các cơ sở như POCT, xét nghiệm tại nhà, đồng ruộng và-thực thi pháp luật tại chỗ. Dựa trên công nghệ MIRA, Amp-công nghệ sinh học tương lai đã phát triển một loạt-sản phẩm xét nghiệm nhanh tại chỗ, bao gồm chất giải phóng axit nucleic nhanh, thuốc thử khuếch đại axit nucleic nhanh đẳng nhiệt, que thử vàng keo và thiết bị cầm tay thu nhỏ, tạo ra giải pháp tổng thể cho-thử nghiệm phân tử nhanh tại chỗ. Hơn nữa, công nghệ MIRA của Amp-future mang lại những lợi thế ứng dụng khi kết hợp với công nghệ CRISPR, NGS, SNP, vi lỏng, v.v.
Ngoài loạt-sản phẩm thử nghiệm nhanh tại chỗ được trình bày ở trên, Amp-công nghệ sinh học trong tương lai còn cung cấp:
Thuốc thử nghiên cứu:Cung cấp nguyên liệu thuốc thử và hỗ trợ kỹ thuật cho nghiên cứu khoa học cơ bản cũng như tài liệu tham khảo về dự án.
Sản xuất OEM:Có khả năng độc lập sản xuất các sản phẩm hoàn thiện có độ tinh khiết cao,{1}}hoạt động cao trong toàn bộ quá trình, đạt được quy mô sản xuất-công nghiệp.
Dự án được ủy quyền phát triển:Thông tin trình tự và kết quả phân tích căn chỉnh trình tự, thiết kế và tổng hợp-thăm dò mồi của dự án, tổng hợp và mẫu plasmid của dự án, báo cáo và kết quả của dự án, v.v.
Để biết thêm thông tin, chào mừng bạn đến hỏi.