Aeromonas hydrophila là một loại vi khuẩn gây bệnh đáng kể trong nuôi trồng thủy sản, gây bệnh nặng ở vật nuôi và gây thiệt hại kinh tế đáng kể. Để cho phép phát hiện nhanh chóng tại chỗ, chúng tôi đã phát triển một nền tảng vi lỏng di động tích hợp quá trình khuếch đại nhanh đẳng nhiệt đa enzyme (MIRA) với khả năng xử lý chất lỏng tự động. Thiết kế chip kết hợp một động cơ rung thu nhỏ và miếng đệm sưởi bằng gốm để duy trì
kiểm soát nhiệt độ chính xác và đảm bảo tính đồng nhất của phản ứng trong suốt quá trình chiết và khuếch đại axit nucleic. Một máy bơm không khí thu nhỏ dẫn dịch chiết DNA thô qua chip chỉ bằng một bước nhỏ để đạt độ chính xác cao.định lượng. DNA chiết xuất sau đó được chuyển đến buồng phản ứng được cài đặt sẵn MIRAthuốc thử để khuếch đại đẳng nhiệt ở 39 độ dưới sự giám sát huỳnh quang theo thời gian thực. Nền tảng này đã phát hiện
A. hydrophila trong các mẫu nước trong vòng 40 phút, đạt phạm vi tuyến tính từ 1 × 10² đến 1 × 10⁷ CFU⋅mL−1và giới hạn phát hiện (LOD) là 10 CFU⋅mL−1. Đáng chú ý, thiết kế mô-đun của nó cho phép dễ dàng trao đổi mồi và đầu dò, giúp nền tảng dễ dàng thích ứng để phát hiện các mầm bệnh vi khuẩn đa dạng trong nuôi trồng thủy sản.
Sơ đồ so sánh nền tảng vi lỏng di động và nền tảng phát hiện thông thường đối với A. hydrophila. (A) Vi lỏng di động
nền tảng. Quy trình phát hiện trên nền tảng này tích hợp chiết xuất axit nucleic, lấy mẫu, khuếch đại và phát hiện chính xác. (B) Nền tảng phát hiện thông thường. Quy trình làm việc dựa trên phòng thí nghiệm-thông thường phụ thuộc vào thiết bị phức tạp, nhân viên được đào tạo và các quy trình tốn nhiều thời gian-.
Đánh giá độ ổn định của nền tảng vi lỏng di động. (A) Hình ảnh của nền tảng vi lỏng di động. (B, C) Hiệu suất nhiệt của buồng tách và phát hiện axit nucleic. Mối quan hệ giữa đệm sưởi gốm và nhiệt độ buồng. (D) Độ ổn định phát hiện huỳnh quang (N=3). Cường độ huỳnh quang được đo trong khoảng thời gian 5 phút trong suốt quá trình khuếch đại.
Đánh giá hiệu suất của nền tảng vi lỏng di động. (A) Đường cong hiệu chuẩn để phát hiện A. hydrophila (N=3). Đường cong hiệu chuẩn được thiết lập bằng cách phát hiện A. hydrophila trong phạm vi nồng độ 1 × 101 –1 × 108 CFU⋅mL−1trong điều kiện tối ưu. (B) Đánh giá khả năng tái tạo chip-đến{2}}chip. Xét nghiệm MIRA đối với A. hydrophila được thực hiện trên mười con chip được chế tạo từ mỗi khuôn trong số hai khuôn độc lập. (C) Phân tích tính đặc hiệu (N=3). Độ đặc hiệu của xét nghiệm MIRA đã được xác thực dựa trên vi khuẩn A. hydrophila mục tiêu và 11 loài vi khuẩn không{10}đích. (D) So sánh với qPCR (N=3). Cả nền tảng và qPCR đều được sử dụng để phát hiện A. hydrophila ở các nồng độ khác nhau. (E) Phát hiện các chủng-phân lập tại hiện trường (N=3). Bốn chủng A. hydrophila phân lập tại hiện trường đã được phát hiện bằng cả nền tảng và qPCR.